روش هاي كشت ياخته :
كشت ارگان :

به صورت كشت بخشي از يك ارگان در محيط هاي غذايي در خارج از بدن است. در اين نوع كشت مي توان از بافت پوششي دستگاه تنفس و يا روده كوچك، بافت عصبي، تخمدان ها و تيروئيد استفاده كرد . كشت ارگان براي مطالعه ويروس هايي است كه در كشت ياخته هاي معمول كه در مراكز ويروس شناسي وجود دارند تكثير نمي يابند.

كشت ياخته (تك لايه) :

بافت مورد نظر را به قطعات lmLm² تقسيم كرده و به آن محلول حاوي يك آنزيم پروتئوليتيك اضافه مي كنند تا در حرارت آزمايشگاه عمل هضم آنزيمي قطعات صورت بگيرد و ياخته هاي بافت از هم جدا گردند. به منظور ممانعت از اثر آنزيم بافت ها را شسته و به آن سرم گوساله اضافه مي كنند. ياخته ها را به تعداد مناسب به محيط كشت كه حاوي سرم جنين گاو و سرم گوساله و آنتي بيوتيك هاي لازم است اضافه و در ظرف استريل ويژه توزيع كرده و در گرم خانه ° 37(سانتی گراد) مي گذارند.
ياخته ها به سرعت به سطح ظرف كشت چسبيده و در شرايط مناسب با استفاده ازمواد غذايي موجود در محيط كشت به صورت يك لايه يكنواخت رشد و تكثير مي يابند.

تركيبات محيط كشت ياخته :
محلول تنظيم شده از نمك هاي فيزيولوژيك – اسيدهاي آمينه پالاكتالبومين – سرم جنين گاو يا سرم گوساله – گلوكز – اكسيژن – معرف رنگي فنل رد

انواع كشت ياخته :
كشت ياخته هاي اوليه : با خارج كردن يكي از ارگان هاي جانور مورد نظر از آن ياخته تهيه مي كنند. اكثر اين ياخته ها 10-5 بار پاساژ را تحمل مي كنند سپس همگي خواهند مرد. به دليل آلوده بودن اين نوع ياخته به برخي ويروس هاي خفته بدن براي توليد واكسن ارزشي ندارد و تهيه آن نيز گران تمام مي شود.

ياخته هاي ديپلوئيد :

ساخته هاي ديپلوئيد 2n كروموزومي اند و همگي از يك نوع ياخته منشأ مي گيرند و تا پاساژ 100 بار پاساژ را تحمل مي كنند از نمونه آن ياخته هاي ديپلوئيد جنين انسان است كه براي اهدافي چون جدا سازي – تعيين هويت ويروس ها – تحقيق در پوردويرس و توليد واكسن استفاده مي شود.

ياخته هاي ماندگار :

از يك ياخته منشأ گرفته اند برخي 2n+1 و برخي 2n-1 كروموزومي هستند تا بي نهايت پاساژ را تحمل مي كنند. به دفعات تكثير مي يابند و مي توان آنها را به صورت معلق در محيط كشت در فرمانتورهاي ويژه كشت دار مانند ياخته Hep₂ كه از سرطان حنجره انسان گرفته شده است.

كاربردهاي كشت ياخته :
- جدا سازي ويروس ها از نمونه هايي كه از جانوران بيمار تهيه مي شوند.
- تهيه واكسن و آنتي ژن هاي گوناگون به منظور كارهاي سرم شناسي
- تحقيق در مورد فعاليت هاي بيولوژيك و بيو شيميايي ويروس ها

آثار مخرب ناشي از تكثير ويروس ها در ياخته (CPE)
بسياري از ويروس ها مي توانند باعث مرگ ياخته هاي ميزبان وياخته هاي ديگر شوند.
تغييرات ياخته هاي آلوده را CPE و ويروس كه باعث بروز آن مي شود را ويروس بيماري زا ياخته گويند.

هماد سورپسون : جذب گلبول های قرمز روی یاخته های روی یاخته ها را گویند که در نتیجه جایسازی گلیکو پروتئین ویروس در پرده سیتوپلاسم یاخته آلوده ایجاد میشود .
هماگلوتيناسيون : جذب ويروس بر روي گيرنده هاي سطح گلبول قرمز را گويند كه در نتيجه جايسازي هماگلوتينين در پرده سيتوپلاسم ياخته، آلوده ايجاد مي شود.
ايمونوفلورنسس : اضافه كردن آنتي بادي كه با رنگ فلورسنت نشاندار شده به ياخته به منظور بررسي وجود ويروس در ياخته هاي آلوده با استفاده از ميكروسكوپ داراي اشعه ماوراء بنفش
انتر فرانس : تكثير يك ويروس در يك لايه كشت ياخته باعث ممانعت از تكثير ويروسي ديگر مي شود. مانند مقاومت ويروس سرخجه در برابر تكثير ويروس اكو 11 كه ارتباطي با آن ندارد.
تخم مرغ هاي جنين دار : داراي مزايايي هستند كه براي تكثير ويروس ها و تهيه واكسن هاي ويروسي از آن ها استفاده مي شود و ساختمان آن به شكل زير است :

راههاي تزريق به تخم مرغ جنين دار :
- تزريق برروي پرده كوريو آلانتوئيك :
- تزريق به داخل حفره آلانتوئيك
- تزريق به داخل حفره آمنيوتيك
- تزريق داخل كيسه زرد

كندلينگ: تخم مرغ را روي حفره داخل جعبه اي كه در داخل آن يك چراغ قرار دارد قرار داده و در يك اتاق تاريك قرار مي دهند. نور چراغ باعث روشن شدن تخم مرغ شده و به راحتي جنين و رگهاي مربوط به آن تشخيص داده مي شود.

روش تزريق :
در راه هاي تزريق ابتدا تخم مرغ را كندل كرده و در جايي كه رگهاي اصلي وجود ندارند يك حفره هوايي مشخص مي كنند و روي پوسته تخم مرغ يك علامت مي زنند و محل علامت زده را استريل مي كنند. (در تزريق پرده كوريو آلانتوئيك و حفره آمينوتيك پوسته اطراف حفره هوايي را كاملاً جدا مي كنند تا تزريق روي پرده متصل به پوسته انجام گيرد.) و( در تزريق حفره آلانتوئيك و كيسه زرد در مركز پوسته روي حفره هوايي يك سوراخ تعبيه مي كنند) و با استفاده از سرنگ مقدار 1/0 ميلي ليتر از مايع تحت آزمايش را تزريق مي كنند. سپس سوراخ ها را با پارافين مايع استريل كرده و مسدود مي كنند و در نهايت تخم مرغ را در گرمخانه قرار مي دهند.

استفاده از حيوان هاي آزمايشگاهي جهت مطالعه ويروس ها :
از حيوان ها براي تهيه ياخته هاي خون، سرمها، آنتي سرمها، آنتي ژن هاي ويروسي استفاده مي شود. مثلاً از مرغ براي توليد آنتي سرم هاي اختصاصي ويروس آنفلوآنزا و ويروس هاي قابل تكثير در تخم مرغ جنين دار، از موش هاي شيرخوار براي تكثير و جداسازي ويروس ها، از خوكچه هاي هندي براي توليد كمپلمان و آنتي سرم ها و تكثير برخي ويروس ها، از خرگوش براي تهيه آنتي سرم ها، از شمپانزه براي مطالعه ويروس هاي عفونت زاي انسان كه در كشت ياخته تكثيرنمي كنند ( مانند عامل بيماري ايدز) استفاده مي شود. در استفاده از اين حيوانات تزريق يا به روش داخل صفاقي، برخي داخل مغزي و برخي نيز داخل عضله و بيني صورت مي گيرد و خون گيري نيز از سياهرگ يا قلب انجام مي شود.

2 – در ظروف كشت ياخته كه درب آنها خوب بسته نميشود براي زنده ماندن ياخته ها چه كار بايد كرد ؟

دراين صورت بايد گاز اكسيد دو كربن به ميزان 5% به هواي گرم خانه اضافه كرد تا PH محيط زياد نشود.

3-مقدار 1/0 میلی لیتر از رقت هایی با فاصله یک لگاریتم از تعلیق ویروس به یک لوله از کشت یاخته حساس تعلیق می شود با توجه به این که برای هر رقت 4 لوله آزمایش شاهد داریم که به آنها فقط محیط کشت اضافه شده عیار ویروس را تعیین کنید ؟

رقت هاي سوسپانسيون ويروس =

	CPEنسبت لوله هاي داراي =
= 3/75	لوله هاي موردمصرف درهررقت

L=-1 d=1 S=3/75 <=  با توجه به اينكه
طبق فرمول => TCID50 = L-d(S-0/5)²LOG = log TCID50=-1-1(3/75-0/5)= -4/25  =>

ویروس تحت مطالعه باید^25/4  10 یعنی 17780 بار رقیق نماییم تا در هر 1/0 میلی لیتر دارای عیار برابر TCID 50  باشد .

4 – چرا در ارزيابي ويروس با استفاده از ميكروسكوپ الكتروني از فسفو تنگستات پتاسيم استفاده مي شود؟
چون فسفو تنگستات پتاسيم اين خاصيت را دارد كه در تمام خلل و فرج ذره ويروس نفوذ كند و از طرفي چون الكترون ها از آن عبور نمي كنند ظاهر يك ويروس رنگ شده را مي توان به خوبي مشاهده كرد.